Surveillance continue du pH de cultures de cellules humaines en suspension et adhérentes

Client / Type de client :

Université médicale de Graz, Biomodèles alternatifs de facilité principale et imagerie préclinique

Problématique / Besoin :

Le pH et l’oxygène dissous sont des paramètres très importants pour la culture des cellules et sont cruciaux pour la croissance et la viabilité des cellules. Avec la croissance cellulaire, le milieu s’acidifie, ce qui peut être observé par le changement de couleur de l’indicateur de pH, le rouge de phénol, qui est ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, la surveillance continue du pH est intéressante car elle permet d’obtenir des informations sur le taux de croissance et les bio créations ou d’utiliser des milieux sans rouge de phénol.

Méthode utilisée / Réponse apportée :

Des mesures de pH en continu ont été effectuées en utilisant une combinaison de plaques de culture à 6 puits avec des pastilles de pH intégrées (PHSP5-PK7).

Deux lignées cellulaires différentes, à savoir Raji et MUG-Mel2, ont été utilisées. Les cellules Raji sont cultivées en suspension, contrairement à la culture adhérente de MUG-Mel2. Différents nombres de cellules ont été cultivés afin d’observer différents changements de pH pendant les mesures continues du pH. La possibilité de mesurer simultanément l’oxygène dissous est également présentée.

Dans cette expérience, deux lignées cellulaires différentes ont été cultivées et le pH et l’oxygène dissous ont été surveillés à l’aide de capteurs optiques de pH PyroScience. Les cellules Raji ont été cultivées dans un milieu RPMI avec 10% de FBS alors que les MUG Mel 2 sont cultivées dans un milieu RPMI avec 10% de FBS et 2mM de L-Glutamine. Les deux ont été cultivées à 37°C dans un incubateur avec 5% de CO2.

Les pastilles de pH stériles (ref PHSP5-PK7-CV, stérilisés avec un rayonnement bêta de 15 kGy) ont été collées dans les puits à l’aide d’une résine époxy à deux composants. Après le durcissement de la colle, les capteurs ont été calibrés à l’aide de tampons de pH 4 et de pH 10 (refs PHCAL4 et PHCAL10) qui ont été filtrés de manière stérile avant d’être utilisés.

La lecture des points a été effectuée par le FireSting pro à 4 canaux et les fibres optiques (ref SPFIB-BARE) qui ont été introduites dans l’incubateur dans la plaque à 6 puits. Pour fixer les fibres optiques, un cadre a été imprimé en 3D qui permet de fixer les fibres directement sous la plaque de 6 puits.

Cellules en suspension de Raji

Les cellules du lymphocyte B de Raji sont cultivées en tant que cellules en suspension. Différents nombres de cellules ont été utilisés pour la culture en double afin d’obtenir différents taux d’acidification du milieu. Les 2 puits n’ont pas été traités avec des cellules servant de référence.

Comme on peut voir dans la figure 2, l’acidification du milieu dépend du nombre de cellules dans le puits. Les duplicatas ont montré une très bonne corrélation. Après le deuxième changement de milieu, on a laissé les cellules se colorer afin d’obtenir des données sur le changement de pH maximal, qui a été mesuré à 6,6. Les pics pendant le suivi peuvent être attribués au retrait de la plaque de puits du cadre imprimé en 3D et donc à une mesure sans le point du capteur sur la fibre optique.

Cellules adhérentes MUG-Mel2

De plus, la culture cellulaire adhérente MUG-Mel2 a été utilisée pour la culture.
Cette fois, 2 pastilles d’oxygène (OXSP5) ont été incluses dans 2 puits pour obtenir des données sur le contenu en oxygène. Les pastilles d’oxygène ont également été stérilisées par rayonnement bêta. La calibration a été effectuée avant l’utilisation à l’air ambiant et avec une solution sans oxygène (solution de Na2SO3 filtrée stérile). Les capteurs de pH ont été à nouveau calibrés avec PHCAL4 et PHCAL10 qui ont été filtrés de manière stérile avant l’utilisation.

Comme les pastilles étaient collées au fond du puits, il était très intéressant de savoir si les cellules allaient adhérer à la surface de détection. La surface des pastilles du capteur d’oxygène est hautement hydroprobe et aucune croissance n’était donc attendue. Le capteur de pH est constitué d’un polymère hydrogel dont la surface présente un certain degré d’hydrophilie. 

Cependant, aucune croissance n’était visible sur le dessus des deux capteurs. La culture de MUG-Mel2 a été suivie pendant 10 jours. 2 puits ont été utilisés sans cellules comme référence. Tous les 3 jours, les cellules ont été trypsinées et suspendues dans un nouveau milieu, ce qui entraîne un changement de pH élevé, de pH < 7,0 à pH du milieu frais (7,3). Les 4 puits montrent une bonne corrélation et aucun point du capteur n'a été influencé par les cellules ou la trypsine. Le milieu de référence montre une légère augmentation du pH de 0,6 unité de pH sur 10 jours. Il s'agit d'une dérive typique des capteurs de pH à 37°C. De plus, la teneur en oxygène de 2 puits contenant des cellules MUG-Mel2 a été contrôlée. Après 100h, un nombre élevé de cellules était visible au microscope indiquant cette forte diminution d'oxygène. Après 200h, la densité cellulaire était déjà plus élevée que dans la culture normale en tant que test de stress. Ce nombre élevé de cellules a permis à l'oxygène de diminuer jusqu'à environ 65% de saturation de l'air.

Autres informations :

Scientifiques concernés : Prof. Beate Rinner, Thomas Hebesberger

Produits liés :

• FSPRO-4
• Pastilles de capteur de pH